重庆仪器校准机构第三方计量校准机构

、设备简介

PE EnVision 2105 多标记微孔板检测系统，主要用于在微孔板上进行光吸收、化学发光、荧光、时间分辨荧光、AlphaScreen以及荧光偏振等所有非放射性标记技术检测，具备的灵敏度、稳定性、和检测速度。

、设备参数与优势

EnVision多标记微孔板检测仪是目前检测速度快的高通量检测仪之一，所有检测技术都是模块化设计，用户可根据需要自由选取适合的检测模块，如以后有新的应用需求和通量要求，可以在用户实验室进行现场升级。作为行业的产品，在光路设计和附件配置方面均有到之处，为用户提供更灵敏、更快速、更灵活的检测体验。

1. 标记物特异的滤光片/二向色镜模块

EnVision多标记检测仪采用滤光片/二向色镜模块光路，其优势是把激发光和发射光完全分离开，避免了检测时的信号干扰，检测的准确性。所有滤光片/二向色镜均配备条形码，软件可自动识别，避免了手动选取光学元件时出错的可能性。

2. 四光栅检测光路

激发和发射均采用双光栅技术，在检测灵敏度的同时大大降低背景信号，可进行所用光吸收和荧光检测。具有全波长扫描功能，可确定待测物质的吸收峰值或荧光激发及发射峰值；具有很大的检测灵活性。

EnVision的滤光片/二向色镜与四光栅混合光路能大限度的兼顾检测灵敏度和灵活性，并提供快的速度和高通量。

3. 低背景的双检测器

EnVision的顶部检测光路采用全透镜模式，不借助光导器或是光纤束，检测速度更快、灵敏度更高。两个温度恒定的红敏光电倍增管（PMT）检测器满足FRET、LANCE、BRET、双报告基因等双发射同时检测分析的要求。

4. 超敏感化学发光

采用的检测器更靠近样品，立的光路设计有效避免相邻样本在检测时的交叉干扰，仅需更少的细胞就能获得比标准化学发光更高的灵敏度，使原代细胞、干细胞或难转染细胞的检测也不再困难。



5. 温度控制

温度控制覆盖整板区域，其范围是室温+2℃至50℃，并且在微孔板顶部有一加热部件，可有效防止冷凝问题。另外有针对AlphaScreen检测的温控模块，AlphaScreen检测过程的稳定性。
6. AlphaScreen

采用680nm激光源，立光路，立的PMT检测器，激发孔的同时检测后一孔，大大提高读板速度，实现高通量检测。

、设备应用

蛋白/核酸定量检测

1. 蛋白质定量

Lowrry法——蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生蓝色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比，在650nm处检测吸光值，根据标准曲线计算样品浓度。

Bradford法——蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。

BCA法——BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，在562nm处检测，大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
2. 核酸定量
PicoGreen染料能特异的与双链DNA（dsDNA）结合，OliGreen能特异的结合寡核苷酸（ssDNA）；双链λDNA或核苷酸溶于10 mM Tris-HCl（1 mM EDTA，pH 7.5）缓冲液，分别加入荧光染料，在激发光485nm、发射光530nm条件下检测荧光信号，核酸浓度和荧光强度成正比。


代谢研究

包括NADH检测、碱性磷酸酶、蛋白酶活性、双报告基因检测、细胞色素P450基因表达等。

1. 碱性磷酸酶检测

碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）广泛分布于机体各脏器器官中，通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团去除，并生成磷酸根离子和自由的羟基，参与各种生化反应。BBTP是一种非荧光物质，当碱性磷酸酶去除其磷酸基团，得到的产物BBT可发出很强的荧光信号；因此，BBTP可作为底物检测碱性磷酸酶活性。检测灵敏度可达0.5 pg/孔（3 amol/孔）。

2. 双报告基因检测

报告基因是用来检测药物作用后细胞内相关蛋白表达水平或转录活性的变化的方法。双报告基因实验系统中，报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照， 使测试不被实验条件变化所干扰。本实验采用萤火虫荧光素酶，结合β-半乳糖苷酶（β-Gal）的双报告基因系统。先在微孔板中加入20µl样本溶液，再加入50µl荧光素试剂和50µl ATP，用检测仪检测1s，读取化学发光信号。然后在微孔板中加入100µl β-Gal底物，孵育15min后，于570nm检测吸光度。化学发光信号值与荧光素酶活性成正比，同时β-Gal变化趋势应与荧光素酶一致。

细胞周期、细胞毒性、细胞凋亡方面的研究
包括细胞活力、氧应激反应、细胞粘连、钙离子检测、CYP介导的药物代谢、ATP检测、蛋白质羟基化、Caspase-3检测等。

1. 细胞活力检测——MTT法

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

2. CYP介导的药物代谢

细胞色素P450（CYP）是药物代谢过程中的关键酶，药物先导分子能否被CYP酶代谢、哪种CYP参与代谢以及先导分子是否会抑制CYP的形成，这些问题对于药物ADME筛选至关重要。实验通过荧光检测快速筛选能抑制CYP2A5形成的先导分子；从小鼠肝脏微粒体获取有活性的CYP2A5，香豆素作为底物能特异的被CYP2A5代谢。反应开始前在微孔板中加入NADPH，37℃孵育10分钟，以60µl 10%TCA终止反应，再加入140µl甘氨酸-NaOH溶液（pH 10.4）增强荧光信号，在355nm激发光和460nm发射光条件下检测代谢产物7-OH-香豆素的含量。先导分子对CYP2A5活性抑制作用越强，则检测到的荧光信号越弱。
3. ATP检测
三磷酸腺苷（ATP）是活细胞的能量储存单元，在细胞中的含量比较稳定，因此ATP的数量与活细胞数量有紧密的相关性。ATP检测常用于细胞增殖、细胞毒性和细胞粘附研究。实验时，在微孔板中加入25µl样本和25µl细胞裂解液，应用分液器每孔加入50µl荧光素酶试剂，延迟1s，检测10s；ATP浓度与化学发光信号成正比，由此推算细胞活性。
4. Caspase-3检测
凋亡是在不产生应答反应的情况下，多细胞生物体清除损伤细胞的一种方式。半胱氨酸酶被称为Caspase，在细胞凋亡初期扮演着重要角色，药物有可能激活或抑制Caspase的产生。因此，在药物研发和癌症研究中，Caspase及其调控机制备受瞩目。PerkinElmer公司开发了一种LANCE方法检测Caspase-3的活性；其原理是，在Caspase-3的四肽底物一端标记Eu，另一端偶联能淬灭Eu荧光的基团QSY™7，当样本表现Caspase-3活性时，四肽底物上淬灭基团被切除，游离的Eu激发后发出荧光，通过荧光强度检测，可计算样本中Caspase-3的含量。此方法无需洗板，快速、灵敏、高信噪比，稳定性、重复性好。

信号通路、GPCR研究

TR-FRET/LANCE检测GPCR信号通路第二信使cAMP：标记Eu的cAMP与携带ULight的抗体结合形成共振能量转移对，当内源性的cAMP释放后可以竞争结合其抗体，从而破坏荧光信号的传递，通过检测665/615信号的改变，检测内源cAMP的含量。LANCE检测方法与传统ELISA方法相比，均相免洗、操作步骤简单、具有更高的检测灵敏度和信噪比。

我们部门有一台脉冲测量仪，国内这几家校准机构都没法校准，只有国外这台设备的厂家可以自校准，这种情况应该怎么处理？答：CNAS-CL016.5.3 技术上不可能计量溯源到 SI 单位时，实验室应证明可计量溯源至适当的 参考对象，如：a) 具备能力的标准物质生产者提供的有证标准物质的标准值；b) 描述清晰的、满足预期用途并通过适当比对予以的参考测量程序、 规定方法或协议标准的结果-。CNAS-RL01:2018 7.6 当测量结果无法溯源至国际单位制（SI）单位或与 SI 单位不相关时，测量结果应溯源至RM、公认的或约定的测量方法/标准，或通过实验室间比对等途径，证明其测量结果与同类实验室的一致性。当采用实验室间比对的方式来提供测量的可信度时，应定期与 3 家以上（含 3 家）实验室比对。可行时，应是获得 CNAS 认可，或 APLAC、ILAC 多边承认协议成员认可的实验室。
在低渗（非常规）储层中，准确地描述水力裂缝有助于进一步理解井产能驱动因素。裂缝扩展模型了各种地质力学和完井信息的真实性，是生成真实裂缝几何形状的有力工具。本项研究基于内部位移不连续性方法（DDM），使用裂缝传播模型（称为ZFRAC）和人工智能（AI）实现工程校准的自动化。该工作流程（ZFRAC-AI）是业内有史以来次对裂缝模型自动校准，将现场规模水平井的校准时间从1周（人工校准）减少到3小时，同时基于泵注压力拟合，获取复杂的裂缝几何形状。

该工作流的过程记录如下。，定义了不确定性参数及其范围。然后，使用拉丁超立方体（LH）抽样方法生成M的初始样本量。接下来，使用ZFRAC模拟这些不确定性以及其他模型输入，并获得模拟的泵注压力响应。基于目标函数，建立了名为XGBoost的机器学习代理模型，迭代优化泵注压力拟合过程。这种类型的迭代将继续进行，直到达到大迭代，或满足收敛性检验。The best

佳拟合的选择基于：（1）稳定注入期间的良好拟合；（2）准确获取瞬时关井压力（ISIP）；（3）整体相对误差小于10%。所开发的ZFRAC-AI工作流已应用于深层页岩气藏水平井。研究结果表明，ZFRAC-AI能够获得所有压裂阶段的一般泵送压力趋势。拟合整个水平井段（32段）的计算时间约为4小时。佳拟合的不确定性参数，如射孔孔数、孔径、摩擦系数和管道压力梯度等，可以得到轻松表征。更重要的是，每个完成段内每簇的平均高度和半长可以很容易地得到量化（平均高度大约为16米，半长大约为42米）。对簇平均高度和半场的量化大大降低了模拟岩石体积（SRV）的估算难度（约264万立方米）。ZFRAC-AI工作流能够缓解繁琐的裂缝模型人工校准问题，尤其是在完井段数较大的情况下。通过这一的工作流程，可以提高表征SRV体积的准确性。本项研究结果可为生产校准（历史拟合）、井距优化和完井设计优化提供有价值的建议。

粗算一下，这些年来大概读过几百篇学生写的报告。总体上，感觉学生在写报告时碰到的大问题是从来没有写过类似的东西，要么不知道写什么，要么不知道怎么写，要么两者都不知道。究其原因，绝大多数同学都是从家门到校门一路读书读上来的，没有真刀真枪地参加过实际工作，他们的经历以课堂学习、做作业和考试为主。大概是学生做久了，不自觉地会养成一种思维上的惯性，完成商务数据分析报告的过程中多少带着一些学生写作业或是写论文的心态。尽管有不少同学中曾参加过各种实习，但由于年资尚浅，做的大多是基层琐碎的事务性工作，公司也没有花太多精力认真培养，很多时候上级布置一个具体的任务，就去找一些数据算一算，完成一些图表，然后回馈给上级，这种感觉还是在做作业/写论文。

某些同学的报告这么写，一个重要原因是他们清楚地知道，是老师来给这份报告打分，于是在他们的潜意识中还是一个学生交作业给老师打分的关系。将报告当成平时作业/论文，将自己当做学生，将老师做当目标受众。而在真实的商业场景中，不管是报告人还是受众，一般都有着不同的角色。因此，我会要求在课程后做演示的时候强调，先构想一个实际的商业环境，对参加pre的所有人进行角色定位，同学们不再是学生的角色，而是“打工人”，老师也不再是教师的身份，也要根据项目调整自己的定位，从不同角度去思考问题。（顺便也挑战一下自己的演技，在几个组的pre中充当了各种角色，如投资人、部门经理、国安局领导，等等）。

建议同学们以后不管是写报告还是作报告，要琢磨一下：我是谁？我为什么要做这个项目？我在什么场合报告？报告的受众是谁？他们的知识背景是什么？他们的对这个报告的期望是什么？对什么东西感兴趣？根据角色定位来决定写什么说什么，怎么写怎么说。

受众可以粗略地分为三种类型，分别是技术、业务和管理者，当然实践中这三种身份往往会有重叠。与之对应，这三类人的兴趣点有着不同侧重：技术一般关心的是how，即技术路线、实现中的与难点、方案的效果如何，等等。业务关心的是what，也就是数据分析结果如何落地，如何应用到生产场景当中，该做哪些事情，不该做哪些事情，要做的话力度有多大合适。管理者关心的除了前两者外（我个人接触下来大多数管理者更偏业务），还会评估如果采纳数据分析得到的建议，成本是多少？收益有多少？风险是什么？再做决策。除此之外，管理者还会站在更高的角度，考虑数据分析工作给整个组织带来的收益与成本，是否有必要常规化数据分析（甚至成立的数据分析部门），是否有下一次合作，等等。当然，这里说的只是一个简单的情况，实际工作中受众的构成与兴趣点会更加复杂，需要根据实际情况调整。但在报告撰写与汇报的准备阶段，考虑照顾到受众的兴趣点，才能受到欢迎。

在我的课程中，一般会建议在报告中尽量照顾到三类受众的兴趣点。一般会要求包涵业务和管理者这两类受众，因为大部分同学由于课程学习的原因和人生经历的原因，相对来说对于技术更加了解，报告写作时喜欢偏向于技术，但是我相信，早日建立起面向不同类型受众的意识，对同学们将来走入职场，是有益的，至少在商学院是这样。

温湿度计计量检定时采用常温下、荫凉、冷冻及其净化车间的温湿度规定不一致，以净化车间应用的温湿度计为例子，GMP规定是温度18℃~26℃、湿度 45%~65%，可是计量检定单位计量检定的情况下是不容易有所差异的，复检的情况下公司能够向计量检定部门建议不一样应用自然环境的温湿度重要检测点关键计量检定。

温湿度计仪器设备校准准备工作：将规范器的摄像头放置恒温恒湿箱个人工作室的管理中心部位，被检仪器设备放置 恒温恒湿箱个人工作室的合理室内空间内，置放的方法与总数应不危害箱里气体循环系统。恒温恒湿箱的个人工作室应确保密封性，且不可置放湿冷或强吸水性原材料。

1.温度校准：温度示值误差校准：校准点应分布均匀在全部检测范围上，不可低于三点。校准箱的温度做到预设值后，应再平稳 30min 后逐渐读数，读熟规范器，后读 被检仪器设备，间距 5min 后反复读数一次。取2次读数的算数平均值为规范器和被检仪器设备的温度量程。

2. 被检仪器设备在各校准点上的温度示值误差均应合乎本规程 5.1 的要求。

3. 湿度校准：湿度示值误差校准：按照从低温干燥到高低温的次序开展校准，校准点应分布均匀在全部检测范围上（一般先后为 40%RH，60%RH，80%RH），不可低于三点。湿度校准时，箱里温度控制精度在 20℃，恒温恒湿箱的湿度做到预设值后，应再平稳 30min 后逐渐读数，读熟规范器，后读被检仪器设备，间距 5min 后反复读数一次。取2次读数的 算数平均值为规范器和被检仪器设备的相对性湿度量程。

4.被检仪器设备在各校准点上的湿度示值误差均应合乎本规程 5.1 的要求。

5.温湿度校准可另外开展。被校仪器设备读数均以看着方法开展。针对指南针仪器设备， 视野应垂直平分内径量表。温湿度计校准与计量检定，温湿度校检结果都是有一个误差指数，以规范45％为例子，被检温湿度计测到的结果可能是43％，也是有可能是47％，自然这两个结果也没有超出要求的差值范畴，该温湿度计全是达标的，可是若没有考虑到误差指数，测到47％的那只温湿度计放到净化车间内应用，当它读数为45％或是46％的情况下，工业厂房内的湿度肯定是小于45％的，因此这只温湿度计在净化车间内检测的湿度低限应当设定为47％，而不是45％，同样别的的检测关键环节也应当考虑到误差指数，温湿度计每一次计量检定结果都需要依据应用自然环境和每一次计量检定结果开展计算设置一个检测上低限，来更的体现检测的结果。

1、内部校准和自校准的区别

“自校准”一般是利用测量设备自带的校准程序或功能(比如智能仪器的开机自校准程序)或设备厂商提供的没有溯源证书的标准样品进行的校准活动，通常情况下，其不是有效的量值溯源活动，但特殊领域另有规定除外。

“内部校准”是指在实验室或其所在组织内部实施的，使用自有的设施和测量标准，校准结果仅用于内部需要，为实现获认可的检测活动相关的测量设备的量值溯源而实施的校准。

因此符合要求的内部校准是CNAS认可的溯源途径，而自校准不是。



2、内部校准适用范围

对于取得CNAS认可的检测实验室，或准备申请CNAS认可的检测实验室，与其获得或申请的认可能力有关的测量设备，如果量值溯源是通过内部校准的途径，则满足CNAS－CL31∶2011《内部校准要求》。

但是如果实验室与其获得或申请的认可能力有关的测量设备内部校准能力，已获得CNAS校准实验室认可或取得法定计量检定机构授权的，则可以认为能满足《内部校准要求》而不需再按CNAS－CL31∶2011《内部校准要求》进行评审。例如有的实验室玻璃量器比较多，如果全部送检，费用大且周期长，影响了检测工作，该实验室向省级计量行政主管部门申请建标并且通过考核，取得了玻璃量器的计量标准考核证书，则可以认为该实验室对玻璃量器的内部校准是符合CNAS要求的量值溯源途径。相关法规规定属于强制检定管理的测量设备，应按规定检定，不能进行内部校准。



3、对人员的要求

从事内部校准的人员应有相应的物理、数学知识，计量学知识及测量不确定度的评定能力。内部校准的人员，应经过相关计量知识、校准技能等必要的培训、考核合格并持证或经授权。



4、对环境条件和设施的要求

实验室实施内部校准的校准环境、设施应满足校准方法的要求。

应确保其环境条件不会使结果无效，或对所要求的校准质量产生不良影响。

对影响内部校准结果的设施和环境条件的技术要求应制定成文件。

当内部校准方法有要求，或对结果的质量有影响时，实验室应监测、控制和记录环境条件。当环境条件危及到内部校准的结果时，应停止校准。



5、对内部校准所用设备及参考标准的要求

实施内部校准应按照校准方法要求配置和使用参考标准和/或标准物质(计量标准)以及辅助设备，其量值溯源应满足CNAS－CL01《检测和校准实验室能力认可准则》第5.6条“测量溯源性”的要求和CNAS－CL06《量值溯源要求》的要求。为确保校准的正确性和可靠性，对参考标准和/或标准物质(计量标准)的建立、考核、维护和正确使用应制定的程序。

应按照规定的程序和日程对参考标准和/或标准物质(计量标准)进行核查，以保持其校准状态的置信度。

参考标准和/或标准物质(计量标准)应进行测量不确定度验证、重复性考核和稳定性考核。



6、对校准方法的要求

计量设备的内部校准方法应采用国家校准规范或部门校准规范，在没有校准规范的情况下，等同采用相应的国家检定规程或部门检定规程。

在没有相应的校准规范或检定规程或其他标准方法时，实验室可以使用自编方法、测量设备制造商推荐的方法等非标方法，使用测量设备制造商推荐的方法时应转化为实验室文件。非标方法应进行方法确认，保存方法确认的记录。



7、内部校准的质量控制

实验室的质量控制程序、质量监督计划应覆盖内部校准活动。参考标准和/或标准物质(计量标准)应参加CNAS承认的实验室间的比对或测量审核或能力验证计划。



8、不确定度要求

实验室应对开展的全部内部校准项目(参数)评估测量不确定度，应在校准证书或记录中报告测量不确定度和(或)给出对其计量规范或相应条款的符合性声明。一般情况下，校准结果应包括测量结果的数值y和其扩展不确定度U。应在校准证书中注明不确定度的包含因子和包含概率，可以使用以下文字描述:“本报告中给出的扩展不确定度是由标准不确定度乘以包含概率约为95%时的包含因子k。”扩展不确定度的数值应不超过两位有效数字，并且应满足以下要求:

1) 终报告的测量结果的末位，应与扩展不确定度的末位对齐;

2) 应根据GB/T8170《数值修约规则与极限数值的表示和判定》的规则进行数值修约。在校准证书中报告测量不确定度的来源时，应包含校准期间短期的不确定度分量。



9、内部校准的记录及报告

内部校准的校准证书可以简化，或不出具校准证书，但校准记录的内容应符合校准方法和认可准则的要求。校准记录应有较长的保存期，以监视被校准测量设备的稳定性。

校准人员的校准结果经过校核人员的核验。校准记录中应包含所用计量标准名称及其性编号，以确保校准过程的复现。



10、内部校准在CNAS认可活动中的要求

在初审、复评和扩项评审时，如果申请认可的检测能力存在内部校准活动时，实验室在申请书中申报，CNAS将安排相关校准领域的评审员，参加现场评审，评审结果实验室内部校准能力不符合要求时，申请认可的相关检测项目或参数不予认可。

如果实验室存在内部校准活动，但申请时未报的，现场评审中，评审组内无相关内部校准的评审能力时，申请认可的相关检测项目或参数不予认可。监督评审中，应覆盖内部校准活动，一般情况下，内部校准能力的覆盖范围与认可的检测能力的监督范围一致。内部校准的结果只能在实验室内部使用，不能对外宣称内部校准项目获得CNAS认可或使用认可标识。

为推进校准实验室认可工作，不断提升校准实验室能力水平，中国合格评定国家认可（CNAS）秘书处于2022年6月29日至30日以网络直播的形式组织举办了校准实验室认可宣贯培训。本次培训主要针对意向申请或已获CNAS认可的校准实验室，2300多名来自全国各地的校准实验室及相关机构的质量管理人员、技术人员参加了培训。

CNAS副秘书长肖良在培训启动会上指出，为了深入贯彻新发展理念，推动发展，更好地服务双循环新发展格局和建设全国统一大市场，更好地落实市场监管总局局长罗文关于“要聚焦主责主业，在强化市场监管、服务经济社会发展上带好头作表率”的指示精神，落实田世宏副局长在今年6月9日世界认可日上的讲话要求，根据常态化防控的需要，CNAS秘书处安排组织了本次线上培训，这是CNAS服务认可对象，履行社会责任的重要举措。肖良还介绍了CNAS概况及新动态，探讨了认可工作面临的新形势新要求，强调要进一步发挥认可作用，规范校准行业的健康发展。

本次培训邀请了中国计量协会秘书长王晓冬对我国计量校准行业动态进行了分析。CNAS校准实验室认可部负责人对校准实验室认可政策和发展趋势进行了解读。CNAS相关工作人员和技术详细讲解了校准实验室认可新技术要求和关键技术要素，并对参加培训人员反映集中的问题进行了解答，帮助各校准实验室、各相关人员加深对认可要求的理解，进一步提升校准实验室认可的有效性和一致性。

在培训满意度调查中，参加培训人员对本次培训给予了高度评价，纷纷表示要将培训所学所获运用到实际工作中，不断提升本实验室的质量管理和能力水平，与CNAS共同推动校准行业的发展。